《水体中微囊藻基因的测定 实时荧光定量PCR法》征求意见

　　【仪表网 仪表标准】由浙江省质量协会组织，嘉兴同济环境研究院主起草的团体标准《水体中微囊藻基因的测定 实时荧光定量PCR法》已完成征求意见稿，根据《团体标准管理规定》(国标委联〔2019〕1 号)、《浙江省质量协会团体标准管理办法》(试行)的有关规定，现公开征求意见。
 

　　近年，水体富营养化已成为一个全球关注的环境问题，在富营养化水体中存在高浓度的营养性物质，如氮、磷等，可促使藻类大量生长形成水华。早在19世纪末，就有动物饮用含有蓝藻污染物的水而出现死亡的相关报道。因此，湖泊富营养化和蓝藻水华是同前全世界共同面临的重大环境问题之一。
 

　　在水华期间，会使湖泊生物多样性下降，而且产毒蓝藻会释放大量生物毒素，其中蓝藻产生的次级代谢产物—微囊藻毒素(Microcystin, MC)危害程度较强，它是一种在蓝藻水华污染中产生量最大、出现频率最高和造成危害最严重的藻毒素种类之一。这些毒素可在鱼、虾、蟹等水生动物富集，经食物链可影响人类健康，既能影响渔业养殖，也可造成饮用水安全等问题。产生微囊藻毒素的藻类主要有蓝藻门微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属，蓝藻毒素通过其危害方式可分为肝毒素和神经毒素，它们是肝癌的强烈促癌剂，另一类毒素对皮肤有刺激作用。当蓝藻细胞破裂或死亡时，毒素就会被释放到水中，常规的水处理工艺不能有效的将它去除。
 

　　许多水体爆发的“水华”是由蓝藻的疯狂生长引起的，而在水华蓝藻中又以微囊藻为优势种，常见的微囊藻中既有产毒株也有不产毒株，常规的蓝藻监测以显微镜下形态观察、计数为主，方法粗略，易漏检或误检。并且产毒株和不产毒株在显微镜下的形态是一样的，肉眼无法分辨，因此常规显微镜镜检法准确度不高，有待于发展既快又准确的产毒微囊藻的检测方法。
 

　　本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化标准的结构和起草规则》的规定起草。参考GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导；HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范；HJ 494 水质采样技术指导等规程内容编制。
 

　　方法原理：
 

　　实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是指在聚合酶链式反应(PCR)反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过最后通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
 

　　本方法运用TaqMan探针法，利用荧光共振能量转移现象，使系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化，通过检测这种变化可测出PCR反应体系中产物的种类和量。
 

　　仪器与设备：
 

　　1.采水器：不锈钢或有机玻璃材质，圆柱形。容量和深度规格要满足采样要求。
 

　　2.微量砂芯过滤器：250 mL，包括漏斗(直径25 mm，容积200 mL)、多孔聚酯滤膜支撑板、收集瓶。
 

　　3.真空泵：相对真空度不高于-17 kPa。
 

　　4.微量冷冻高速离心机：1.5 mL转子，转速不低于14000 rpm。
 

　　5.离心机：2 mL，转速不低于6000 rpm。
 

　　6.振荡混匀器。
 

　　7.荧光定量PCR仪：温度范围4.0 ℃～99.9 ℃。
 

　　8.PCR反应管：根据qPCR仪要求选择单管、八联排管或96孔荧光反应板。
 

　　9.烘箱：60 ℃ ± 2 ℃。
 

　　10.水浴装置：加热温度可调，可精确调至植物DNA提取试剂盒说明书要求的温度。
 

　　11.微量移液器：2 μL、10 μL、50 μL、200 μL和1000 μL
 

　　12.移液枪或移液管：10 mL。
 

　　13.酒精喷壶：100 mL～250 mL。
 

　　14.不锈钢镊子。
 

　　15.冰箱：规格为4 ℃和-20 ℃。
 

　　16.冷藏箱。
 

　　17.二级生物安全柜。
 

　　18.计时器。
 

　　19.高压灭菌器。
 

　　本标准规定了测定水体中总微囊藻基因和产毒微囊藻基因的实时荧光定量PCR法。本标准适用于饮用水、地表水中总微囊藻基因和产毒微囊藻基因的测定。
 

　　本标准样品当水样提取体积为30mL时，总微囊藻基因检出限为50copies/mL，测定下限为200copies/mL；产毒微囊藻基因的检出限为38copies/mL，测定下限为15copies/mL。(更多详情请见附件)